Enzymet, der knækker naturens hårdeste materialer

Hvert år forbliver enorme mængder biologiske ressourcer fra skovbrug, landbrug og havet uudnyttede. En måde at omsætte dem på er ved hjælp af enzymer, men processerne er ofte langsomme og dyre. Selv små forbedringer i effektiviteten kan derfor få stor økonomisk betydning.

I begyndelsen lignede det et protein, de fleste forskere ville registrere og gå videre fra – lille, næsten uden særlige kendetegn og med evne til at binde sig til kitin i skaller, svampe og insekter. Måske nyttigt. Men næppe banebrydende.

Da Eijsinks forskergruppe tilsatte det til enzymer, der nedbryder kitin, skete der noget uventet.

”Reaktionen tog fart. Markant. Materialer, der ellers havde modstået nedbrydning, begyndte at give efter. Men den virkelige overraskelse var ikke bare, at det virkede – men hvordan,” siger professor Vincent Eijsink fra Norges Miljø- og Biovidenskabelige Universitet.

Disse enzymer er med til at frigøre værdien i materialer, vi ellers har svært ved at udnytte – fra træ og planterester til rejeskaller. Det, der lignede en ubetydelig hjælper, viste sig at være en del af en mere grundlæggende strategi, som naturen bruger til at åbne selv de mest genstridige materialer.

Han så, hvordan form bliver til funktion

Inden Vincent Eijsink blev kendt for enzymer, der kan bryde nogle af naturens hårdeste materialer op, var det proteinernes form, som han var fascineret af – et helt grundlæggende træk ved biologien.

Han voksede op i Holland og studerede molekylærvidenskab i Wageningen netop i en tid, hvor bioteknologien var ved at tage form. For første gang nøjedes forskere ikke med at beskrive biologiske molekyler – de begyndte også at ændre dem.

”Det fascinerede mig fuldstændigt,” siger Eijsink.

Det, der fangede ham, var, at proteiner udfører kemi ved at folde sig til tredimensionelle strukturer. ”Et protein er i princippet bare en kæde af aminosyrer,” siger han, ”men alligevel folder den kæde sig til en struktur, der kan udføre bemærkelsesværdige reaktioner.”

Han flyttede til Groningen for at tage en ph.d. i proteinteknologi i slutningen af 1980’erne, hvor selv ændringen af én enkelt aminosyre var en stor bedrift. Reagenserne var dyre, og de computerværktøjer, man i dag tager for givet, var kun lige begyndt at dukke op.

”Hver mutant var en fest,” siger Eijsink.

”Det var fascinerende – men også helt nyt. Vi vidste ikke altid, hvad vi lavede - vi var på opdagelse.”

Forståelsen kom først – og ændrede alt

Eijsinks ph.d.-arbejde tog udgangspunkt i et konkret problem: hvordan man gør enzymer mere stabile, så de kan fungere under industrielle forhold. Skridt for skridt førte en voksende forståelse af proteinstabilitet til artiklen Engineering an enzyme to resist boiling – et tidligt højdepunkt i hans karriere.

Arbejdet formede også hans tilgang til bioteknologi.

”Hvis vi vil lave fornuftig anvendt forskning – hvis vi vil bidrage med løsninger i samfundet – begynder det med forståelse,” siger han. Ikke kun hvad et enzym gør, men hvorfor det virker – hvad der gør en struktur stabil eller skrøbelig.

Den tilgang har han holdt fast i: at koble dyb indsigt med praktisk anvendelse.

”Det har været fantastisk at kigge på en proteinstruktur om morgenen og en reaktor om eftermiddagen,” siger han. ”For os hænger de to ting uløseligt sammen.”

På tværs af projekter er balancen mellem grundforskning og anvendelse blevet ved med at være central.

”Den grundlæggende idé er den samme: forståelse og anvendelse følges ad.”

Med tiden blev det også til noget mere specifikt: en særlig måde at se på proteiner – især dem, andre overså.

Den sans – at stoppe op ved det, andre gik forbi – skulle vise sig at blive afgørende. Et af de proteiner, der kom til at ændre hans karriere, havde i årevis været ignoreret.

Proteinet alle overså

I 1990’erne ændrede et besøg fra en norsk forsker i Groningen både Vincent Eijsinks forskningsretning – og hans liv.

”Der var en norsk gæsteforsker – en kvindelig norsk gæsteforsker – der kom til laboratoriet, og som fangede min interesse, hvis jeg må formulere det sådan,” siger han. ”Og, ja, slutningen på historien er, at vi stadig er sammen.”

Videnskabeligt handlede besøget om at udtrykke chitinaser i mælkesyrebakterier for at give dem svampedræbende egenskaber. Men det førte også Eijsink til Norge, hvor hans forskning gradvist bevægede sig fra enkelte proteiner til spørgsmålet om, hvordan biologien nedbryder hårde materialer.

Et af disse materialer er kitin. Ligesom cellulose i planter er kitin et udbredt polysaccharid, som er stift og svært at nedbryde. Det indgår i svampecellevægge, insekters exoskeletter og krebsdyrs skaller – strukturer, der er bygget til at holde.

Den klassiske forklaring på nedbrydningen var enkel. Enzymer kaldet chitinaser spalter polymererne ved hydrolyse, hvor vand bruges til at bryde bindingerne. Det var en klar og pæn model – og den fungerede, et stykke ad vejen.

I virkeligheden er materialerne tætpakkede og ofte krystallinske, og det er energimæssigt krævende at bryde dem ned.

”I årevis antog man, at hydrolytiske enzymer var de vigtigste redskaber,” siger Eijsink. ”Men det passede ikke helt med det, vi så i naturen.”

Hvis hydrolytiske enzymer havde svært ved at angribe materialet, hvordan kunne mikroorganismer så nedbryde det så effektivt? Der begyndte at dukke tegn op. Nogle systemer fungerede bedre end forventet. Visse proteiner dukkede igen og igen op – de bandt sig til kitin, men uden tydeligt at nedbryde det.

De var lette at overse. Klassificeret som hjælpere. Ikke som enzymer. Måske nyttige – men ikke afgørende.

Gennembruddet, ingen så komme

CBP21 – Chitin-Binding Protein (21 kDa) – var allerede kendt. Andre forskere havde set det og var gået videre. Det viste ingen klar aktivitet og passede ikke ind i den hydrolytiske model.

”I begyndelsen var vi ganske enkelt bare nysgerrige,” siger Eijsink.

I starten af dette årtusinde ville en ph.d.-studerende i hans gruppe, Gustav Vaaje-Kolstad, se nærmere på det.

”Da Gustav sagde, at han ville arbejde med proteinet, spurgte jeg: Er du sikker?” siger Eijsink. ”Jeg troede ikke, det ville hjælpe os med at nedbryde kitin.”

Men proteinet blev ved med at dukke op i systemer, der nedbrød kitin.

”Faktum er, at det konsekvent blev produceret af bakterier, der voksede på kitin,” siger han. ”Hvis naturen bevarer noget, er det der af en grund.”

Arbejdet fortsatte – og så kom overraskelsen.

”Da CBP21 blev tilsat chitinaser, steg nedbrydningen af kitin.”

Det pegede på, at proteinet gjorde noget – ikke ved selv at klippe materialet i stykker, men ved at ændre, hvordan de andre enzymer kunne arbejde.

”Det havde vi ikke forventet,” siger Eijsink. ”Og vi forstod endnu ikke, hvor stort det var. Bedømmerne var mere begejstrede end vi var.”

I første omgang kunne resultatet stadig passes ind i den eksisterende model. Måske hjalp proteinet med at løsne strukturen – mange ledte efter den slags ”løsende” proteiner på det tidspunkt. En rimelig forklaring, men ikke en fuldstændig.

For noget stemte ikke.

Gradvist tegnede der sig et andet billede.

”Proteinet bandt sig ikke bare til kitin. Det ændrede det. Der var noget andet på spil.”

Gustav Vaaje-Kolstad og Vincent Eijsink.

Eksperimentet afslørede en skjult kemi

Gennembruddet kom, da Eijsink og hans team holdt op med at gå ud fra, at de forstod reaktionen – og i stedet begyndte systematisk at ændre betingelserne.

”Vi begyndte at tilsætte metaller til reaktionen,” siger Eijsink. ”Derefter tilføjede vi C-vitamin – og indså pludselig, at vi faktisk fodrede systemet med elektroner. Kontrolforsøget viste sig at være gennembruddet.”

Det var her, alt skiftede. Reaktionen viste sig at afhænge af elektroner – bindingerne blev ikke brudt af vand, men via oxidation.

”Vi indså, at vi stod med noget helt andet,” siger han. ”Ikke et protein, der bare binder – men et enzym, der udfører en kemi, ingen havde set før.”

Proteinet, der ændrede kemien

Flere forsøg bekræftede billedet. Under de rette betingelser kunne proteinet endda selv nedbryde kitin. Rollen for CBP21 faldt på plads: i stedet for blot at hjælpe hydrolysen satte det aktivt processen i gang.

”Det angriber materialets overflade og skaber åbninger – indgange, som andre enzymer kan udnytte. Det, vi troede var en hjælper, viste sig at være afgørende.”

I 2010 publicerede forskergruppen opdagelsen i Science. En ny enzymklasse blev defineret: lytiske polysaccharidmonooxygenaser – LPMO’er.

Samtidig begyndte lignende observationer at dukke op i systemer, der nedbryder cellulose. Enzymer uden tydelig hydrolytisk funktion viste sig at øge nedbrydningen på samme uventede måde.

Det, der først blev set i kitin, var ikke en undtagelse.

I årtier havde man forstået nedbrydningen af materialer som kitin og cellulose som en rent hydrolytisk proces. Det billede var ufuldstændigt. En oxidativ kemi havde hele tiden været en del af processen.

Opdagelsen tvang forskere til at tænke biomasseomdannelse på ny. LPMO’er bruger oxidation til at angribe overfladen af tætpakkede, krystallinske materialer – områder, som klassiske enzymer ikke kan nå.

Processen viste sig at være todelt: oxidation åbner strukturen, og hydrolyse fuldender nedbrydningen.

”Folk var nødt til at gentænke deres strategier for at omdanne biomasse,” siger Eijsink.

Enzymet viste sig at være overalt

I de følgende år begyndte beviserne at samle sig.

LPMO’er blev fundet overalt i biologien – kodet i bakterier og svampe, der nedbryder plantebiomasse og kitinrige materialer. I nogle organismer pegede snesevis af LPMO-gener på et mere komplekst billede: forskellige enzymer, der sandsynligvis var rettet mod forskellige dele af disse sammensatte materialer.

”Det tog noget tid, før folk indså, hvor vigtige disse enzymer er,” tilføjer Eijsink.

Efterhånden som flere data kom til, blev billedet klarere. Enzymerne havde et karakteristisk kobberbaseret aktivt center, og deres reaktioner efterlod oxiderede produkter. Uafhængige spor pegede mod den samme konklusion.

Det, der havde set ud som en undtagelse, begyndte at ligne en regel.

”Alt ved disse enzymer er nyt – mekanismen, det aktive center, reaktionen – og de er industrielt vigtige,” siger han.

I årtier havde forskere haft mistanke om, at hydrolytiske enzymer alene ikke kunne forklare, hvordan materialer som cellulose blev nedbrudt i naturen. Allerede i 1950’erne havde den berømte cellulaseforsker Elwyn Reese foreslået en manglende komponent – en ”C1-faktor” – der gjorde materialet tilgængeligt.

Ingen havde fundet den. LPMO’erne viste sig at være netop det.

”C1-faktoren var endelig fundet,” siger Eijsink.

Feltet begyndte at omorganisere sig omkring den idé.

Fra opdagelse til industriel gennembrudskraft

Enzymer, der tidligere var blevet klassificeret som inaktive, blev omklassificeret, og forskerne begyndte ikke kun at lede efter hydrolytiske enzymer, men også efter deres oxidative partnere. Den virkelige betydning viste sig i industrien, hvor store mængder plantebiomasse skal forarbejdes effektivt.

”Det er svært at nedbryde plantebiomasse i industriel skala, fordi strukturen er tætpakket og modstandsdygtig. Klassiske enzymer kan nedbryde de tilgængelige områder, men de har svært ved de mest krystallinske dele – og det øger omkostningerne og begrænser effektiviteten.”

LPMO’er ændrede dette. Ved at angribe disse områder oxidativt gjorde de materialet mere tilgængeligt for de enzymer, der allerede blev brugt i industrien.

I løbet af de seneste to årtier har udviklinger som disse været med til at gøre omdannelsen af biomasse mere effektiv og bragt processer som produktion af biobrændstof tættere på industriel levedygtighed.

Ilt var ikke svaret

Men historien sluttede ikke der. Hvis LPMO’er havde ændret måden, hvorpå biomasse blev nedbrudt, opstod der et nyt spørgsmål: Hvad drev dem egentlig?

”I 2010 tog vi fejl, ligesom alle andre i de tidlige år,” siger Eijsink. ”Vores data tydede på, at LPMO’er bruger molekylært ilt; faktisk gennemførte vi ret avancerede eksperimenter, der syntes at vise, at LPMO’er, ligesom andre monooxygenaser, bruger ilt.”

Men noget stemte ikke.

”Enzymsystemet opførte sig ikke som forventet; vi kunne ikke forstå kinetikken,” siger han.

Resultaterne var inkonsekvente. Reaktionshastighederne var lavere end forventet.

En detalje var blevet overset: Der blev dannet små mængder hydrogenperoxid i baggrunden – og det drev reaktionen.

Omhyggelige eksperimenter gav en radikal ny indsigt: LPMO’er bruger ikke ilt direkte; de bruger hydrogenperoxid. I standardreaktioner dannes hydrogenperoxid og driver reaktionen – men det kan også tilsættes direkte.

Korrektionen, der vendte modellen på hovedet

Opdagelsen af hydrogenperoxids rolle forklarede, hvorfor reaktionerne opførte sig uventet, og hvorfor de tidligere data ikke gav mening.

”Vi mener, at det slet ikke er monooxygenaser,” siger Eijsink. ”Det er peroxygenaser. Navnet LPMO blev hængende – men kemien er anderledes.”

Ideen mødte modstand. Den iltbaserede model var veletableret, og at erstatte den betød, at mange års data skulle fortolkes på ny.

Hydrogenperoxid udgjorde også et problem. Det er reaktivt og ustabilt – og kan beskadige enzymer, hvis det ikke kontrolleres omhyggeligt.

Når små mængder hydrogenperoxid blev tilsat under kontrollerede forhold, steg reaktionshastighederne dramatisk, og enzymer, der havde virket usædvanligt langsomme, opførte sig mere som typiske enzymer.

Derfor ændrede hydrogenperoxid hele historien

Skiftet fra ilt til hydrogenperoxid gjorde mere end blot at korrigere kemien. Hvis hydrogenperoxid driver reaktionen, bliver det afgørende at kontrollere det. I industrielle sammenhænge fik det øjeblikkelig betydning: kontrolleret dosering øgede reaktionshastighederne og forbedrede udbyttet.

”Der var en del debat,” siger Eijsink. ”Men når folk først så dataene – og især hvad der sker, når man tilsætter hydrogenperoxid – blev det svært at argumentere imod.”

Efterhånden som flere grupper reproducerede resultaterne, slog den nye model igennem. Den erstattede ikke den gamle fuldstændigt – den forfinede den.

”Samtidig viste flere undersøgelser fra forskellige forskningsgrupper, at LPMO’er anvender meget kraftfuld kemi.”

Disse fund begyndte at omforme både forskning og anvendelse.

Ikke et mirakel – men en gamechanger

LPMO’er nedbryder ikke kompleks biomasse på egen hånd. Men kombineret med eksisterende enzymer forbedrer de processen. Selv beskedne effektivitetsgevinster kan have en betydelig økonomisk indvirkning.

”De er vigtige redskaber til at øge proceseffektiviteten,” siger Eijsink. ”Selv forbedringer på nogle få procent kan have en enorm økonomisk betydning.”

Tilsætning af LPMO’er reducerede den nødvendige mængde enzymer og øgede udbyttet. I nogle tilfælde faldt enzymforbruget med op til halvdelen, mens sukkerfrigivelsen steg med op til 60 %.

”Det kan virke skuffende, at det ikke er en faktor to eller mere,” siger han. ”Det er nogle få procent – men det betyder stadig meget. Og vi har måske ikke set det bedste fra LPMO’er endnu.”

Kraftfulde enzymer med en farlig bagside

Den samme kemi, der gør LPMO’er effektive, gør dem også skrøbelige.

”Det er meget kraftfulde enzymer,” siger Eijsink. ”Men det gør dem også svære at kontrollere.”

Under de forkerte betingelser beskadiger LPMO’er sig selv.

”Hvis man udsætter et LPMO for de forkerte betingelser, vil det blot beskadige sig selv,” siger han. ”Og vi tror, at det sker i en hel del bioreaktorer rundt om i verden.”

Dette skaber et praktisk paradoks: De enzymer, der forbedrer omdannelsen af biomasse, er også blandt de sværeste at håndtere. For lidt hydrogenperoxid, og reaktionen bremses. For meget, og enzymet nedbrydes.

”Man er nødt til at kontrollere forholdene nøje,” siger Eijsink.

Når kontrollen bryder sammen i virkeligheden

I praksis er den kontrol vanskelig. Når LPMO’er virker på biomasse, opererer de i et kaotisk system af reaktive molekyler.

”Det er et meget komplekst system,” siger Eijsink. ”Der er elektroner og reaktive iltarter, der bevæger sig rundt overalt, og dem skal man kontrollere.”

En vigtig faktor er lignin, som deltager i reaktioner, der både genererer og nedbryder hydrogenperoxid, hvilket forstyrrer processen på flere måder.

Det, der fungerer under rene laboratorieforhold, er meget sværere at kontrollere i virkelige industrielle systemer.

”Derfor er ydeevnen svær at forudsige – og endnu sværere at optimere. Naturen har haft millioner af år til at finde den rette balance. Industrielle bioteknologer er stadig ved at lære.”

Vincent Eijsink.

Fra biomasse til et nyt princip i naturen

Denne kemi er udfordrende – men den åbner også muligheder ud over biomasse. LPMO’er kan være nyttige overalt, hvor overflader skal nedbrydes eller modificeres, snarere end blot at blive kløvet.

”Ved at modificere overflader i stedet for blot at kløve kæder kan disse enzymer ændre egenskaberne hos materialer som cellulose og kitin. Det åbner muligheder inden for områder som materialevidenskab og affaldsudnyttelse, der rækker ud over blot at nedbryde ting.”

Inden for et årti havde opdagelsen omformet både forskning og industriel praksis.

“Spørgsmålet er nu, hvor langt man kan strække dette princip,” siger Eijsink. “Hvor langt denne kemi kan udvides – og hvor grænserne går. Vi ville meget gerne få LPMO’er til at katalysere andre vanskelige reaktioner, såsom selektiv oxidation af små molekyler, der er vigtige i den kemiske industri.”

Det forskerne stadig ikke forstår

Et varigt bidrag lukker ikke et emne – det åbner det. I takt med at feltet udvidede sig, dukkede nye spørgsmål op.

Hvorfor producerer nogle mikrober så mange forskellige LPMO’er? Plantecellevægge er komplekse sammensætninger af forskellige polymerer, og forskellige lytiske polysaccharidmonooxygenaser (LPMO’er) kan have udviklet sig til at målrette forskellige dele af denne struktur – ikke kun cellulose. Hvilke LPMO’er er så de mest egnede, når man forarbejder plantebiomasse?

Spørgsmålene er både praktiske og grundlæggende: Hvilke strukturer virker LPMO’er på? Under hvilke betingelser fungerer disse enzymer bedst? Hvordan styres deres aktivitet i levende systemer – og hvordan undgår de at beskadige sig selv?

”For lidt, og reaktionen bremses. For meget, og enzymet ødelægger sig selv. At forstå, hvordan denne balance opretholdes – i naturen og i industrielle systemer – er fortsat en udfordring.”

Ud over biomasse: en skjult rolle i sygdom

Spørgsmålene rækker ud over biomasse.

”For nogle mikrobielle patogener er disse enzymer absolut afgørende,” siger Eijsink. ”Hvis man fjerner dem, bliver organismen langt mindre effektiv til at forårsage sygdom.”

LPMO’er er nu blevet identificeret i patogene organismer, herunder bakterier, svampe og oomyceter.

”I visse tilfælde kan man ved at målrette LPMO’erne i disse mikrobielle patogener reducere virulensen dramatisk,” siger han. ”Det gør LPMO’er meget interessante set fra et medicinsk perspektiv.”

Hvad de laver i disse systemer, er stadig uklart.

”Det fascinerende er, at vi stadig ikke rigtig ved, hvad de laver der,” siger Eijsink.

Det, der begyndte som en korrektion af en eksisterende model for nedbrydning af robuste polysaccharider, er blevet til noget større: en måde at forstå, hvordan naturen bruger kontrolleret redoxkemi til at løse vanskelige problemer.

LPMO’er ændrede biologien

Ved første øjekast kan opdagelsen af LPMO’er virke som en teknisk forfining – et ekstra enzym og en klarere mekanisme.

Men ændringen var mere vidtrækkende: hvordan naturen udnytter meget kraftfuld redoxkemi til sin fordel.

”LPMO’er viser, hvordan sådan kemi kan bruges på en kontrolleret og målrettet måde til at angribe meget resistente materialer,” siger Eijsink.

Ikke ukontrolleret, men styret: begrænset til specifikke steder og strengt reguleret.

LPMO’er er slående i deres strukturelle enkelhed: små enzymer, der kun kræver ét kobberion for at katalysere en vanskelig reaktion. I modsætning hertil er andre enzymer, der udfører tilsvarende krævende kemi, ofte mere komplekse og sværere at anvende i praksis.

”Andre naturlige enzymer, der katalyserer lige så udfordrende reaktioner, såsom den kontrollerede oxidation af metan til methanol, har tendens til at være meget mere komplekse og svære at producere,” bemærker Eijsink.

Hvad angår nedbrydning af polysaccharider, er den vigtigste nye indsigt integrationen af fundamentalt forskellige typer kemi.

Det, der engang virkede som en mindre tilføjelse, viste sig at være den manglende brik.

De nye muligheder

Dette skift i perspektiv tyder på, at proteiner, der er blevet afvist som inaktive, kan have roller, vi endnu ikke forstår – og at redoxkemi kan være til stede, hvor vi ikke har ledt efter den.

”Nogle gange lærer vi ikke bare af naturen,” siger Eijsink. ”Vi forsøger at lære naturen, hvordan man gør noget nyt.”

En ambition er at udvide denne kemi til mere robuste syntetiske materialer, herunder plast – ved hjælp af enzymer, der er designet til at angribe overflader, som biologien ikke har udviklet sig til at håndtere.

”Jeg drives ikke af store visioner,” siger Eijsink. ”Jeg forsøger at bedrive god videnskab – og følge, hvor den fører hen.”

”Jeg har altid været fascineret af enzymer,” siger han. ”De kan udføre kompliceret kemi meget præcist ved 37 grader i vand – det er simpelthen bemærkelsesværdigt.”

I dag er LPMO’er en fast bestanddel af de industrielle enzymsystemer, der anvendes til omdannelse af biomasse. Men deres virkemåde er stadig ikke fuldt ud forstået.

Forskere fortsætter med at undersøge, hvordan deres aktivitet reguleres, hvordan de interagerer med andre enzymer, og hvordan de kan stabiliseres under komplekse, virkelige forhold.

Det protein, der engang syntes ubetydeligt, er blevet noget andet: ikke en undtagelse, men et spor.

”Nogle gange er vejen frem ikke at forfine den eksisterende model – men at erkende, at der hele tiden har været noget fundamentalt anderledes.”