EN / DA
Foto: Novo Nordisk Fonden
Sygdom og behandling

Manden med den gyldne DNA-saks

Et lille bakterie har vendt op og ned på verden, som vi kendte den for blot få år siden. Der skulle dog gå 25 år, før forskere forstod, hvad det var, bakterien gemte på. Den litauiske kemiker Virginijus Siksnys knækkede koden. Han viste, hvordan en lille saks i bakteriernes indre kan bruges til at klippe og klistre gener sammen på en ny måde. Denne teknologi har et så utrolig potentiale, at den kan helbrede de syge og endda hjælpe med at redde miljøet, hvis vi lærer at bruge den rigtigt.

At kunne klippe korrekt er centralt i mennesker og de fleste andre organismer. Sukker skal klippes i mindre enheder, før vi kan bruge det. Proteiner fra vira eller bakterier skal klippes i mindre stykker, så immunsystemet kan gemme og genkende det fremmede. Og DNA-stykker med fejl i skal klippes ud og erstattes med det rigtige for at beskytte os mod genetiske sygdomme, herunder kræft.

Disse molekyler med sakselignende funktioner klipper med en præcision, hastighed og på en størrelsesskala, der får alle menneskeskabte sakse til at blegne.

Drømmen om at finde og kontrollere naturens enestående sakse har fascineret forskningens verden i mindst et halvt århundrede, siden man fandt de første eksempler. Virginijus Siksnys har været med på det meste af denne rejse, og det var derfor meget passende ham, der først lærte at forstå og bruge den lige nu mest gyldne af alle sakse: CRISPR-Cas [udtales krisper/kas].

Da brugen af dette genteknologiske værktøj har et enormt potentiale, er der uenighed om, hvem der egentlig har opdaget den først. Det var dog aldrig penge og succes, der drev Siksnys og det var meget tæt på, at det aldrig var gået sådan.

“Efter så mange år i feltet var jeg var faktisk blevet træt af at forsøge at finde det perfekte klippeværktøj, og jeg var derfor godt på vej til at skifte videnskabelig løbebane, da jeg faldt over en artikel om immunsystemer hos bakterier. Den fik mig til at spærre øjnene op – mest fordi det virkede, som om bakterierne faktisk lignede mennesker i deres evne til at huske de organismer, der tidligere har forsøgt at angribe dem, så de kan angribe dem effektivt næste gang de angriber,” forklarer Virginijus Siksnys.

Historien om den gyldne CRISPR-Cas-saks er således endnu en forskningshistorie om, at det oftest er i jagten på at forstå naturen, at man finder de mest værdifulde skatte – og oftest der, hvor man mindst af alt venter det.

En bakteriebombe

Eventyret om den gyldne saks starter for Virginijus Siksnys vedkommende et helt andet sted. Han studerede kemi ved Vilnius Universitet og fik sin ph.d. fra Moskvas Statsuniversitet, hvor han forskede i enzymer, der klipper i proteiner. Da han vendte tilbage til Institute of Biotechnology i Vilnius, besluttede han sig for at undersøge det meget fundamentale spørgsmål, nemlig hvordan bakterierne beskytter sig mod virus – såkaldte bakteriofager.

“I modsætning til mennesker, der har mange celler, er bakterier encellede. Hvis en virus først får overtaget hos en bakterie, er det derfor ikke kun ude med den ene celle, men med hele bakterien. De har altså kun et forsøg til at slå en udefrakommende organisme ned. Derfor er de nødt til at have et meget effektivt forsvar til at beskytte sig med.”

Bakteriers forsvar består i første række af de såkaldte restriktionsenzymer, der kan klippe DNA i stykker og dermed ødelægge fremmede organismers DNA. Om et DNA-molekyle klippes eller ej, afhænger af selve DNA-sekvensen. Eksempelvis har E. coli restriktionsenzymet EcoR1, der klipper ved DNA-sekvensen GAATTC. Visse bakterier er derfor nødt til at beskytte eget DNA med metylgrupper, så restriktionsenzymerne ikke ødelægger det.

“Da jeg startede som forsker i 1980’erne, kendte man kun et meget begrænset antal af disse enzymer. Enzymerne vandt dog hurtigt udbredelse som et uundværlig redskab til at klippe i gensekvenser og splejse nye gener ind. I stedet for at forske i at finde nye enzymer, var det, der interesserede mig, og stadig interesserer mig i dag, at forstå, hvordan enzymerne opnår deres funktion.”

Behovet for sakse stiger

Virginijus Siksnys byggede fra 1982 og 20 år frem et kraftcenter op på Vilnius Universitet indenfor forskningsområdet. Fokus var på strukturelle og molekylære mekanismer i restriktionsenzymer, som f.eks. hvordan restriktionsenzymer kan genkende særlige DNA-sekvenser, hvilke fælles strukturer enzymerne havde, og hvordan enzymernes struktur kunne kobles til deres funktionen.

“Vi håbede, at vi, ved at finde svar på disse spørgsmål, ville blive i stand til at forstå enzymernes mekanismer så godt, at vi også ville kunne ændre på dem og dermed også på deres funktion. Ultimativt kunne det betyde, at vi ville blive i stand til at konstruere helt nye typer af restriktionsenzymer, der klippede på nøjagtig de steder, hvor vi gerne ville have de skulle.”

Behovet for specifikke sakse steg op gennem 1990’erne i takt med, at genteknologien tog fart. Jo mere viden der kom omkring specifikke gener fra forskellige organismers genomer, desto større blev ønsket og behovet fra forskningsverdenen for enzymer, der f.eks. kunne klippe gener ud af en organisme for derefter at indsætte dem ind i en anden.

“I dag kender vi hele 330 forskellige typer af restriktionsenzymer fra flere end 4.000 kendte bakteriearter, så diversiteten er utrolig stor, men selv om vi blev eksperter i at undersøge og forstå de biokemiske mekanismer, og selv om vi med Røntgenkrystallografi kunne bestemme strukturen, var vi kun i begrænset omfang i stand til, med datidens teknologi, at ændre på enzymerne.”

Træt af sakse

Metoder til at ændre enzymer var dengang stadig primitive og langsommelige. Et enzym som EcoR1 består af en kæde på 277 aminosyrer i en bestemt rækkefølge. For at ændre på enzymet måtte forskerne udskifte aminosyrerne enkeltvis, teste om enzymet virkede anderledes, ændre endnu én og teste igen.

“Selv om vores mange strukturelle undersøgelser gav os en god ide om, hvilke aminosyrer vi skulle ændre, var det som at finde en nål i en høstak. Omkring 2005 syntes jeg, at jeg var nået til en skillevej, hvor vejen med restriktionsenzymer syntes at ende blindt.”

Virginijus Siksnys havde derfor besluttet at gå helt nye veje forskningsmæssigt, men nogle uventede og spændende forskningsresultater fik ham til at ændre den beslutning

Francisco Mojica, en ung spansk forsker, havde opdaget nogle mystiske strukturer i bakterien Haloferax mediterranei. Mojica studser over rækker af gentagne DNA-sekvenser, der alle er præcis 30 basepar – og adskilt af mellemrum på præcis 36 basepar. Mojica bliver nærmest besat af strukturerne og bruger de næste 10 år på at finde en forklaring.

Strukturernes blev døbt Clustered Regularly Interspaced Palindromic Repeats – eller bare CRISPR.

Gætterierne begynder herefter. Mojica ved, at CRISPR-sekvenserne må have en funktion, siden de evolutionært er bevaret i så mange forskellige bakterier. Hvilken ved han dog ikke. Han foreslår både, at CRISPR er involveret i regulering af generne, til reparation af DNA og flere andre funktioner. Da han endelig rammer rigtigt i 2005, tror ingen ham rigtig. Han foreslår nemlig, at CRISPR er bakteriernes eget avancerede immunsystem.

CRISPR-fænomenet skaber dog ikke megen opmærksomhed de næste par år, men som det tit sker, når der sker opsigtsvækkende fund inden for videnskabens verden, accelererer forskningen pludselig inden for området. I 2005 tager CRISPR-forskningen fart, og det næste afgørende skridt fik for alvor Virginijus Siksnys til at vende blikket tilbage mod den vej, som han få år tidligere havde forladt. Fundet kom et lettere overraskende sted fra: sauerkraut.

Yoghurt og sauerkraut

I Frankrig havde ph.d.-studerende Philippe Horvath viet sin afhandling til at undersøge noget så eksotisk som genetikken for mælkesyrebakterier i sauerkraut. Horvath blev herefter hyret af Rhodia Food til at undersøge de mælkesyrebakterier, de brugte. Deres problem var nemlig, at bakterierne de brugte til yoghurtproduktion ofte blev angrebet af bakteriofager, så hele produktionen blev ødelagt.

Horvath undersøgte bakterierne, som han vidste var blevet resistente over for specifikke bakteriofager. Han undersøgte deres genom og fandt, at bakterierne havde skåret DNA-fragmenter ud fra bakteriofager og gemt dem i deres eget genom – midt mellem de tidligere omtalte CRISPR-sekvenser.

Horvath havde hørt om CRISPR allerede i 2002 og havde derfor øje for den potentielle vigtighed, så da han fandt det selvsamme system i de mælkesyrebakterier, han arbejdede med, besluttede han sig for at kigge nærmere på deres gener sammen med en anden ung ph.d.-studerende, Rodolphe Barrangou fra Danisco USA, samt bakteriofageksperten Sylvain Moineau fra Quebec.

“De små DNA-fragmenter fra fagerne, som bakterierne gemmer, sætter dem i stand til at genkende fagerne, næste gang de angriber. Det, der for alvor fik mig til at spærre øjnene op, var, at der i nærheden af de gentagne CRISPR-sekvenser befandt sig et gen, cas9, og at Cas 9-proteinet indeholdt gensekvenser, som vi tidligere havde fundet i andre restriktionsenzymer.”

Bakterierne har altså tilsyneladende placeret CRISPR – deres hukommelse om indtrængende fjender – klos op og ned ad noget, der tilsyneladende kan klippe, Cas. Endnu er der dog lang vej til at forstå CRISPR-Cas, og ikke mindst potentialet, men enzymeksperten Siksnys har fået genvakt sin interesse for bakteriernes immunsakse.

“Hele min oprindelige interesse for enzymer opstod fra bakteriernes immunsystem. Så det er klart, at virkelig var en øjenåbner pludselig at læse, at bakterier ikke kun havde et primitivt immunsystem, men også et langt mere avanceret immunsystem.”

Et afgørende øjeblik

Mens Virginijus Siksnys er gået i gang med at studere de potentielle restriktionsenzymer, begynder brikkerne til resten af CRISPR-Cas-puslespillet langsomt at blive fundet.

Enkeltbrikker lægges af forskere fra hele verden. John Van de Oost fra Holland finder ud af, at de små DNA-gensekvenser, som CRISPR gemmer for at kunne huske de indtrængende fager, oversættes til små RNA-molekyler (crRNA), der kan bevæge sig ud i cellen og guide enzymsaksene hen til den bakteriofag, der skal angribes. Emmanuelle Charpentier fra Umeå University i Sverige finder senere, at crRNA har brug for en følgesvend – et andet RNA-guidemolekyle (tracrRNA) – for at kunne finde de indtrængende fager.

Med den viden lykkes det i 2011 Virginijus Siksnys som den første at samle og flytte hele CRISPR-Cas-pakken fra en bakterie, der er resistent overfor bakteriofagerne, Streptococcus thermophilus, ind i en ikke-resistent E. coli-bakterie og vise, at denne pakke er nok til at sætte E. coli-bakterien i stand til at bekæmpe de udefrakommende fjender.

“Det var et afgørende øjeblik for os. Det kunne sagtens have vist sig, at vi stadig manglede nogle komponenter, eller at man ikke bare kunne flytte systemet fra en organisme til en anden. Med det her resultat var vi klar over, at vi havde hele pakken samlet og kunne flytte den frit rundt, men vi manglede stadig at forstå, hvordan den virkede.”

De amerikanske forskere Luciano Marraffini og Erik Sontheimer havde godt nok vist, at CRISPR-Cas slog bakteriofagerne ud ved at klippe i deres DNA, og Sylvain Moineau havde vist, at Cas9 formentlig var den enzymsaks, der klippede. Forskerne havde således alle brikkerne til puslespillet liggende foran sig. Men de manglede at samle det.

Når man knap tror sine egne øjne

Kapløbet om først at samle brikkerne spidsede nu for alvor til, og det er stadig vanskeligt at afgøre, hvem der egentlig kom først over målstregen. Men det billede, der dukkede op, var til gengæld prægtigere, end nogen kunne have forestillet sig.

Efter i første omgang at have klonet hele CRISPR-Cas-pakken og fået den til at virke i en anden bakterie, var Siksnys klar til at kaste sig over sit ekspertfelt: enzymer.

Tiden var kommet til at finde frem til, hvordan Cas9 - det enzym, som man regnede med, at bakterierne brugte – rent faktisk angreb bakteriofagerne. Siksnys og hans kolleger lavede derfor et grundigt studie, hvor de i reagensglas med kun CRISPR-Cas og DNA til stede først bekræftede, at det var CRISPR-Cas, der var enzymsaksen, der klippede bakteriofagers DNA i stykker.

Siksnys’ næste opdagelse var endnu mere overraskende og afgørende for det gennembrud, som CRISPR-Cas-systemet efterfølgende fik.

“Vi havde jo en stærk mistanke om, at Cas9-enzymet kun klippede DNA-stykkerne, hvis de svarede nøjagtig til de DNA-sekvenser, som bakterierne havde gemt fra tidligere angreb. Så vi tænkte: ‘Hvad hvis vi nu prøver at skifte dem. Kan vi så få enzymet til at klippe det sted vi gerne vil have det til?’”

Forskerne kunne knap tro deres egne øjne. Det de havde arbejdet på i flere årtier – nemlig at reprogrammere et restriktionsenzym – kunne nu klares med et snuptag. Ved at ændre en 20 basepar lang sekvens i crRNA, klippede Cas9 nu et nyt sted. Nemlig der, hvor forskerne havde bedt det om.

Stort set samtidig kom Emmanuelle Charpentier og hendes amerikanske kollega, Jennifer Doudna, på lidt anden vis frem til nøjagtig det samme resultat. Siksnys indsendte sit manuskript i april 2017 til tidsskriftet Cell, der dog afviste det, da de ikke fandt det vigtigt nok. Derfor måtte han indsende det på ny til PNAS, hvor artiklen endelig udkom 4. september 2012. Charpentier og Doudna havde indsendt to måneder efter, men alligevel udkom artiklen allerede 8. juni i tidsskriftet Science.

De to artikler er allerede milepæle indenfor biovidenskab

Saksen bliver forgyldt

Taken together, these findings pave the way for the development of unique molecular tools for RNA-directed DNA surgery’ skrev Siksnys i sin artikel

Konsekvensen af de nye resultater var, at forskningsverdenen nu stod med et genteknologisk værktøj, hvor de meget nøjagtigt kunne klippe beskadigede gensekvenser ud og derefter, ved at tilsætte de rigtige sekvenser, kunne reparere defekte genomer.

I løbet af et halvt år var ordet CRISPR blandt de allermest søgte ord på Google. Da Feng Zhang fra MIT i Boston i januar 2013 kunne berette i Science, at han havde brugt CRISPR-Cas til at redigere i det menneskelige genom, eksploderede internettet af interesse.

De potentielle anvendelsesmuligheder af CRISPR-Cas synes nemlig uudtømmelige. Man kan ikke blot potentielt helbrede sygdomme ved at reparere genetiske fejl, men også introducere genetiske fejl og på den måde studere genetisk betingede sygdomme og dermed nemmere teste ny medicin. Og man kan langt nemmere producere medicin, enzymer og andre stoffer med den nye vidundersaks.

CRISPR-Cas har også skabt bioetiske bekymringer, da teknologien potentielt kan bruges til at introducere særlige egenskaber i fostre. Endnu er denne del af CRISPR-Cas science fiction. Virksomheder verden over slås om rettighederne, mens mange forskere maner til besindighed og ønsker et moratorium, så man ikke begynder at anvende teknologien, før den er moden til det.

Alt imens CRISPR-Cas-debatten fejer hen over verden, er en af dens hovedpersoner tilbage i laboratoriet i Vilnius – tilbage hvor han startede, og hvor han agter at fortsætte de næste mange år. Med den grundlæggende forskning.

“Det vigtigste man, i mine øjne, kan lære af CRISPR-Cas er, at grundlaget for den var grundforskning. Det vigtigste gennembrud kommer oftest ud af helt uforudsigelig oprindelse. Min mission var at lære at forstå bakterierne og deres forsvarsværker – ikke at redigere det humane genom eller studere sygdomme hos mennesker. Hvis vi havde haft øjnene stift rettet mod det mål, havde vi nok aldrig nået det.”

Novozymes Prisen 2017 blev fredag d. 17. marts 2017 uddelt til Professor Emmanuelle Charpentier, Department of Regulation in Infection Biology, Max Planck Institute for Infection Biology, Berlin, Tyskland, og Professor Virginijus Siksnys, Institute of Biotechnology, Vilnius University, Litauen.

Virginijus Šikšnys
Chief Scientist and Head
Virginijus Šikšnys studied organic chemistry at Vilnius University, receiving his Masters in 1978, then moved to Lomonosov Moscow State University, where he studied enzyme kinetics and received Candidate of Sciences degree (equivalent to PhD) in 1983. From 1982 until 1993 he worked at the Institute of Applied Enzymology in Vilnius. In 1993 he was a visiting scientist in prof. Robert Huber’s laboratory at the Max-Planck-Institut für Biochemie, Martinsried, Germany. Since 1995 Virginijus Šikšnys Šikšnys is the chief scientist and head of the Department of Protein-DNA Interactions at the Vilnius University Institute of Biotechnology, since 2006 – professor at Vilnius University and a member of the Lithuanian Academy of Sciences, since 2007 – chair of the Institute of Biotechnology Council.